A la recherche d’une source alternative de globules rouges

Amélioration des conditions d’amplification in vitro à l’aide de JMP®

Défi
Maximiser la qualité et la quantité de la production de globules rouges in vitro, tout en optimisant l’utilisation des ressources d’expérimentation.
SolutionUtilisation de logiciel JMP pour la conception et l’analyse de plans d’expériences afin d’étudier l’impact des différentes variables pour atteindre ses objectifs cliniques.
Résultats
- G ain de temps et de budgét dans la mise en oeuvre des expériences.
- Multiplication par 3 de la production de globules rouges in vitro, en 4 mois seulement.

80 millions de poches de sang sont utilisées chaque année dans le monde. Cependant la demande s’accroit et ne peut être entièrement couverte par les dons en raison de l’indisponibilité de certains groupes sanguins rares, d’une part et de difficultés d’approvisionnement, d’autre part. Dans ce contexte de nombreuses solutions, comme l’élaboration d’hémoglobine artificielle, ont été imaginées, mais la plus prometteuse reste la production in vitro de globules rouges à partir de cellules souches.

Cette thématique est le fer de lance du Professeur Luc Douay, hématologiste à la Faculté de Médecine de l’Université Pierre et Marie Curie (UPMC) et chef de service d’hématologie biologique à l’Hôpital Saint Antoine à Paris, qui dirige depuis 2007, au sein de l’UMR S938, l’équipe «Prolifération et différentiation des cellules souches.» En collaboration avec l’Etablissement Français du Sang (EFS), son équipe travaille à concevoir des protocoles permettant d’obtenir des taux de prolifération en adéquation avec une utilisation transfusionnelle.

Nos efforts sont concentrés plus particulièrement sur le potentiel des cellules du sang de cordon (sang contenu dans le cordon ombilical) et des cellules souches pluripotentes induites (iPS) et sur l’amélioration de ces méthodes de production in vitro » précise le Professeur Douay. «Nous avons ainsi été les premiers à parvenir à produire des globules rouges énucléés (sans noyau) in vitro, à partir de cellules souches » ajoute-t-il.

Dans ce cadre, Laurence Guyonneau- Harmand, Ingénieure de recherche- PhD, se consacre à l’optimisation des conditions de culture, afin de produire plus et mieux. Elle nous détaille l’apport du logiciel JMP dans la conception et l’analyse de plans d’expériences…

La culture cellulaire : des expériences coûteuses et délicates...

Afin de répondre aux caractéristiques d’un produit potentiellement transfusable, l’augmentation de la production de globules rouges et l’amélioration de leur qualité sont deux priorités. Objectif : passer d’une production « de paillasse » à une production de masse industrielle!

« Problème : les expérimentations (milieu de culture, etc.) nécessaires pour atteindre ces objectifs sont coûteuses, et les cellules aussi précieuses que rares » explique Laurence Guyonneau-Harmand. «Afin d’économiser au maximum nos ressources, il nous fallait optimiser nos méthodes de travail en laboratoire».

Jusqu’en 2007, l’empirisme a prévalu: chacun des différents facteurs d’une expérience sont testés de façon itérative, à raison de 3 tests (triplicate) pour obtenir une valeur moyenne, entraînant une surconsommation des ressources. De plus, il n’était possible de faire varier qu’un seul critère à la fois. Les données étaient ensuite saisies dans un tableur qui offrait une vision très limitée de leurs interactions.

« Avec JMP, les résultats des expériences se modélisent intuitivement et je visualise directement les effets (synergiques, inhibiteurs…) des variables qui m’intéressent.» Laurence Guyonneau-Harmand, Ingénieure de recherche-PhD.

Optimiser en amont pour atteindre les objectifs

L’utilisation, en amont, du logiciel JMP a permis d’optimiser les ressources du laboratoire tant en matériel biologique qu’en temps. Grâce à ses fonctionnalités adaptées, il permet de préparer des plans d’expérience avant de les mettre en pratique. Mais aussi de tester plusieurs paramètres en même temps.

Ces algorithmes statistiques déterminent les effets de chaque facteur et précisent comment ils agissent dans le processus : synergie, inhibition, etc… Dans le cadre des recherches visant à augmenter la prolifération cellulaire et l’expulsion du noyau pour obtenir des globules rouges, des paramètres clefs identifiés grâce à la littérature ont été étudiés.

Il a suffi de saisir la fourchette de valeurs (issues de la bibliographie) pour chaque facteur, puis de renseigner les réponses qui seront mesurées (prolifération, taux d’énucléations). Ici, un plan de type Central composite centré, un plan basé sur des points axiaux, qui a été retenu. Le logiciel s’est chargé du reste en générant automatiquement un plan de 17 expériences correspondantes. «J’ai pu optimiser les valeurs des composants à chaque phase du cycle de développement des cellules grâce au Profileur de JMP.», explique Laurence Guyonneau-Harmand.

Comprendre les interactions des données

Après 4 mois d’expériences, les premiers résultats obtenus n’étaient pas immédiatement satisfaisants. «Le logiciel JMP nous a de nouveau aidé à analyser les paramètres et à identifier les causes de cette contre-performance».

Grâce à ses représentations visuelles, le logiciel permet de repérer facilement l’impact de chaque variable à chaque phase. «J’ai ainsi constaté que lors d’une phase clef d’amplification, les conditions de culture préconisées modifiaient le métabolisme des cellules, j’en ai déduit qu’un temps d’adaptation leur était nécessaire et j’ai donc rallongé cette phase de quelques jours.»

Une production de globules rouges triplée !

Avec ce simple ajustement, les objectifs de prolifération et d’énucléation ont pu être atteints. « En testant ces nouvelles variables, le taux d’amplification des cellules s’est avéré bien supérieur à celui couramment obtenu.».

Les perspectives sont d’envergure: « Auparavant la perspective de production à partir d’un sang de cordon équivalait à 50 poches de globules rouges et à présent elle est de 150 poches de globules rouges. Des résultats plus que satisfaisants pour un premier plan d’expériences! ».

Pourquoi JMP ?

Le choix de JMP s’est naturellement imposé notamment pour ses fonctionnalités spécifiques de plans d’expérience qui n’existent pas dans d’autres logiciels. «Parfaitement adaptées à notre travail en laboratoire, elles sont en outre très faciles d’utilisation et d’accès même sans être statisticien. La construction des plans d’expérience est également très intuitive. » Enfin, les possibilités de représentation des données sous divers graphiques très visuels facilitent la communication des résultats et leur compréhension rapide.

Et demain ?

Cette première application réussie de JMP donne déjà d’autres idées aux chercheurs, en particulier de l’étendre aux cellules ES (« Embryonic stem ») et iPS (« Induced pluripotent stem cells »), particulièrement intéressantes pour leur aptitude à s’auto-renouveler. L’utilisation des plans optimaux permettra certainement de continuer à optimiser l’utilisation des ressources tout en minimisant le risque d’erreur. Pour une utilisation des plans d’expériences toujours plus efficace !

80 millions de poches de sang sont utilisées chaque année dans le monde. Cependant la demande s’accroit et ne peut être entièrement couverte par les dons en raison de l’indisponibilité de certains groupes sanguins rares, d’une part et de difficultés d’approvisionnement, d’autre part. Dans ce contexte de nombreuses solutions, comme l’élaboration d’hémoglobine artificielle, ont été imaginées, mais la plus prometteuse reste la production in vitro de globules rouges à partir de cellules souches.

Cette thématique est le fer de lance du Professeur Luc Douay, hématologiste à la Faculté de Médecine de l’Université Pierre et Marie Curie (UPMC) et chef de service d’hématologie biologique à l’Hôpital Saint Antoine à Paris, qui dirige depuis 2007, au sein de l’UMR S938, l’équipe «Prolifération et différentiation des cellules souches.» En collaboration avec l’Etablissement Français du Sang (EFS), son équipe travaille à concevoir des protocoles permettant d’obtenir des taux de prolifération en adéquation avec une utilisation transfusionnelle.

Nos efforts sont concentrés plus particulièrement sur le potentiel des cellules du sang de cordon (sang contenu dans le cordon ombilical) et des cellules souches pluripotentes induites (iPS) et sur l’amélioration de ces méthodes de production in vitro » précise le Professeur Douay. «Nous avons ainsi été les premiers à parvenir à produire des globules rouges énucléés (sans noyau) in vitro, à partir de cellules souches » ajoute-t-il.

Dans ce cadre, Laurence Guyonneau- Harmand, Ingénieure de recherche- PhD, se consacre à l’optimisation des conditions de culture, afin de produire plus et mieux. Elle nous détaille l’apport du logiciel JMP dans la conception et l’analyse de plans d’expériences…

La culture cellulaire : des expériences coûteuses et délicates...

Afin de répondre aux caractéristiques d’un produit potentiellement transfusable, l’augmentation de la production de globules rouges et l’amélioration de leur qualité sont deux priorités. Objectif : passer d’une production « de paillasse » à une production de masse industrielle!

« Problème : les expérimentations (milieu de culture, etc.) nécessaires pour atteindre ces objectifs sont coûteuses, et les cellules aussi précieuses que rares » explique Laurence Guyonneau-Harmand. «Afin d’économiser au maximum nos ressources, il nous fallait optimiser nos méthodes de travail en laboratoire».

Jusqu’en 2007, l’empirisme a prévalu: chacun des différents facteurs d’une expérience sont testés de façon itérative, à raison de 3 tests (triplicate) pour obtenir une valeur moyenne, entraînant une surconsommation des ressources. De plus, il n’était possible de faire varier qu’un seul critère à la fois. Les données étaient ensuite saisies dans un tableur qui offrait une vision très limitée de leurs interactions.

« Avec JMP, les résultats des expériences se modélisent intuitivement et je visualise directement les effets (synergiques, inhibiteurs…) des variables qui m’intéressent.» Laurence Guyonneau-Harmand, Ingénieure de recherche-PhD.

Optimiser en amont pour atteindre les objectifs

L’utilisation, en amont, du logiciel JMP a permis d’optimiser les ressources du laboratoire tant en matériel biologique qu’en temps. Grâce à ses fonctionnalités adaptées, il permet de préparer des plans d’expérience avant de les mettre en pratique. Mais aussi de tester plusieurs paramètres en même temps.

Ces algorithmes statistiques déterminent les effets de chaque facteur et précisent comment ils agissent dans le processus : synergie, inhibition, etc… Dans le cadre des recherches visant à augmenter la prolifération cellulaire et l’expulsion du noyau pour obtenir des globules rouges, des paramètres clefs identifiés grâce à la littérature ont été étudiés.

Il a suffi de saisir la fourchette de valeurs (issues de la bibliographie) pour chaque facteur, puis de renseigner les réponses qui seront mesurées (prolifération, taux d’énucléations). Ici, un plan de type Central composite centré, un plan basé sur des points axiaux, qui a été retenu. Le logiciel s’est chargé du reste en générant automatiquement un plan de 17 expériences correspondantes. «J’ai pu optimiser les valeurs des composants à chaque phase du cycle de développement des cellules grâce au Profileur de JMP.», explique Laurence Guyonneau-Harmand.

Comprendre les interactions des données

Après 4 mois d’expériences, les premiers résultats obtenus n’étaient pas immédiatement satisfaisants. «Le logiciel JMP nous a de nouveau aidé à analyser les paramètres et à identifier les causes de cette contre-performance».

Grâce à ses représentations visuelles, le logiciel permet de repérer facilement l’impact de chaque variable à chaque phase. «J’ai ainsi constaté que lors d’une phase clef d’amplification, les conditions de culture préconisées modifiaient le métabolisme des cellules, j’en ai déduit qu’un temps d’adaptation leur était nécessaire et j’ai donc rallongé cette phase de quelques jours.»

Une production de globules rouges triplée !

Avec ce simple ajustement, les objectifs de prolifération et d’énucléation ont pu être atteints. « En testant ces nouvelles variables, le taux d’amplification des cellules s’est avéré bien supérieur à celui couramment obtenu.».

Les perspectives sont d’envergure: « Auparavant la perspective de production à partir d’un sang de cordon équivalait à 50 poches de globules rouges et à présent elle est de 150 poches de globules rouges. Des résultats plus que satisfaisants pour un premier plan d’expériences! ».

Pourquoi JMP ?

Le choix de JMP s’est naturellement imposé notamment pour ses fonctionnalités spécifiques de plans d’expérience qui n’existent pas dans d’autres logiciels. «Parfaitement adaptées à notre travail en laboratoire, elles sont en outre très faciles d’utilisation et d’accès même sans être statisticien. La construction des plans d’expérience est également très intuitive. » Enfin, les possibilités de représentation des données sous divers graphiques très visuels facilitent la communication des résultats et leur compréhension rapide.

Et demain ?

Cette première application réussie de JMP donne déjà d’autres idées aux chercheurs, en particulier de l’étendre aux cellules ES (« Embryonic stem ») et iPS (« Induced pluripotent stem cells »), particulièrement intéressantes pour leur aptitude à s’auto-renouveler. L’utilisation des plans optimaux permettra certainement de continuer à optimiser l’utilisation des ressources tout en minimisant le risque d’erreur. Pour une utilisation des plans d’expériences toujours plus efficace !

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Découvrez comment l’EFS a réussi à maximiser la qualité et la quantité de la production de globules rouges in vitro, tout en optimisant l’utilisation des ressources d’expérimentation.

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